免疫治疗与肿瘤微环境
癌症免疫疗法近来获得令人振奋的进展，迎来了肿瘤治疗的新时代。在本综述中，我们将着重研究TME如何影响免疫治疗的疗效，以及在某些情况下如何调节TME来改善当前的免疫治疗方案。
摘要
癌症免疫疗法近来获得令人振奋的进展，迎来了肿瘤治疗的新时代。免疫治疗可以在晚期癌症患者身上引起比常规化疗更大的空前的持续应答。然而，这一应答仅发生在相对少部分患者身上。免疫治疗的阳性反应通常依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境（TME）内免疫调节的相互作用。在这些相互作用下，肿瘤微环境在抑制或增强免疫应答中发挥着重要的作用。认识免疫治疗与TME间的相互作用不仅是剖析作用机制的关键，为改善目前免疫治疗的疗效提供新的方法也具有十分重要的意义。在本综述中，我们将着重研究TME如何影响免疫治疗的疗效，以及在某些情况下如何调节TME来改善当前的免疫治疗方案。
前言
通过免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，癌症免疫治疗在多种癌症患者身上显示出了显著的长期疗效。癌症的常规治疗，如放疗和化疗，通常作用于肿瘤细胞本身，并且可以引发大部分患者的反应。尽管这些常规治疗在初期会产生应答，但是在长期治疗后的癌症晚期常出现复发和耐药。与常规疗法显著不同，免疫疗法通过作用于免疫系统而引发免疫系统抗肿瘤响应。免疫检查点抑制剂临床试验显示出了前所未有的持续响应，尽管这仅限于一小部分患者。因此，免疫治疗首要任务是弄清其详细的作用机制，以及如何将这种积极的响应扩展到更多患者身上。
在体外免疫系统能够识别肿瘤抗原并杀伤肿瘤细胞。然而，要消除机体内形成的肿瘤仅靠识别肿瘤抗原是不够的。一个成型的肿瘤是一个复杂的组织，它不仅由肿瘤细胞组成，还包括也基质细胞，炎症细胞，脉管系统和细胞外基质（ECM），所有这些总和定义为肿瘤微环境（TME）。通过免疫治疗成功控制肿瘤需要免疫系统的激活，效应细胞的扩增，活化的效应细胞浸润到肿瘤组织并破坏肿瘤细胞（图1）。然而TME常阻碍效应淋巴细胞致敏，降低其浸润能力，并抑制浸润的效应细胞，从而导致机体的抗肿瘤作用出现损害。免疫治疗的抗性机制包括如下：（1）抑制性微环境或缺乏抗原刺激/协同刺激的免疫细胞，尤其是T细胞，可能会促使TME内肿瘤的生长和免疫逃逸；（2）生物屏障对肿瘤组织的包裹可导致免疫细胞迁移进肿瘤部位的数量不足；（3）有限的抗原特异性T细胞群短暂激活或耗竭未能抑制肿瘤生长；（4）由于TME的作用肿瘤抗原向引流淋巴结释放不足，淋巴组织内直接或间接抗原递呈量少，导致缺乏T细胞致敏。因此，对免疫治疗与TME间相互作用更好的了解，可能会为提高目前免疫治疗应答率提供新的方法。由于TME在常规治疗中影响近期已有综述，我们将侧重于对免疫治疗和TME之间的相互作用的了解。
图1：免疫治疗和肿瘤微环境（TME）。免疫治疗成功控制肿瘤需要免疫系统的激活，效应细胞扩增，活化的效应细胞对肿瘤组织的浸润并破坏肿瘤细胞。免疫治疗的目的旨在增强上述过程，而肿瘤屏障可以大大抑制它们。效应T细胞可以被TME中检查点的分子，如PD-L1抑制。PD-L1的抑制作用可以通抗-PD1 / PDL1来克服。激发检查点抗体用于激活免疫细胞。但是，一些抗体，如抗CD40也可以在基质细胞发挥优化肿瘤控制的作用。将ECM形成肿瘤屏障阻止T细胞到达TME破坏肿瘤。另一方面，淋巴细胞向TME中的浸润可以通过细胞因子/趋化因子的诱导/递送得到增强。
免疫治疗和TME之间的相互作用
免疫调节抗体
检查点封闭抗体
免疫检查点是指通过共抑制或共刺激信号一系列途径以调节T细胞活性，以防止在正常情况下发生自身免疫疾病的功能。越来越多的证据表明，肿瘤使用这些重要机制的多种途径，以逃逸抗肿瘤免疫反应。其中，针对细胞程序性死亡受体（PD-1）以及PD-1配体（PD-L1或B7H1）的抑制剂，在临床试验中显示的疗效给人留下了深刻的印象。PD-1主要表达于活化的T细胞表面，尽管PD-L1在正常组织中表达有限，但是在一些肿瘤细胞上的表达大幅增加。有趣的是，如果经过炎性细胞因子刺激，特别是干扰素（IFN），许多细胞可出现PD-L1表达上调。PD-L1与T细胞上PD-1结合抑制T细胞活化并诱导T细胞凋亡。这一模式表明肿瘤细胞表达PD-L1抑制T细胞浸润肿瘤，导致机体抗肿瘤作用失效。通过对PD-L1阳性肿瘤患者更容易出现抗PD-1治疗应答的初步观察，这一观点受到支持。然而，随着患者样本的增多，一些肿瘤细胞PD-L1阴性的患者也同样被观察到对PD-1治疗产生响应。此外，最近回溯性临床研究表明，PD-L1封闭响应和肿瘤浸润性免疫细胞PD-L1的表达之间有高度相关性。这项研究提出了一个可能，即在TME中除肿瘤细胞以外，其他细胞上PD-L1的表达会对免疫逃逸发挥重要的作用。
为了提高检查点封闭疗法的应答率开发了一些联合治疗方法。其中，PD-1与细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTL-A4)组合在临床试验中显示出了最好的改善。CTL-A4是主要表达在调节性T细胞（Tregs）上的另一个检查点分子。通过抗CTL-A4阻断该途径耗竭肿瘤组织中的Treg细胞，造成抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的扩增。协同效应主要受限于局部TME，协同效应中成瘤后封锁淋巴细胞迁移没有作用。
免疫激活单克隆抗体
与一旦激活就会抑制免疫反应的PD-1和CTL-A4相比，以CD40/CD40配体（CD40L）为代表的可促进免疫应答的不同类别的免疫检查点通路。CD40表达于B细胞，单核细胞和树突状细胞（DC）。CD40L主要表达于活化的T细胞和血小板。通过CD40激活抗原递呈细胞信号并诱导共刺激和MHC分子的表达，从而加强抗原递呈作用和T细胞致敏。模拟CD40L与CD40结合的抗体已被开发，在体外和体内都可以激活免疫反应；此外，这类抗体已进入临床试验并显示出了充满前景的结果。有趣的是，尽管原始机制表明T细胞致敏在CD40活化之后，后来的研究显示T细胞可能是非必需的，至少在某些肿瘤模型中是这样。具体地说，在小鼠胰腺导管腺癌模型中，通过抗CD40诱导肿瘤消退依赖于巨噬细胞，而不是T细胞。抗CD40激活巨噬细胞，然后转移至肿瘤组织引发肿瘤基质的耗竭来导致肿瘤的消退。有观点认为，不仅在肿瘤模型中，在其他疾病模型中基质细胞对CD40激动剂疗效发挥重要的作用。的确，在Bouchlaka等最近研究中发现，对老年小鼠使用CD40激动剂联合IL-2可诱发细胞因子风暴并致死。后续研究显示，CD40诱导内脏脂肪组织中的巨噬细胞活化。这些活化的巨噬细胞产生了高水平的IFN，并导致了细胞因子风暴。为何只是老年小鼠会致命的一种可能的解释就是老年小鼠器官内比年轻小鼠积蓄更多的脂肪。由于很多癌症的发病率老年群体会更高，在CD40应用于不同癌症患者时，应考虑到这个不利因素的影响。关于CD40/CD40L的报道是一个有趣的案例，这表明有些时候TME是免疫治疗的主要目标，而不是肿瘤细胞。
CAR-T细胞
CAR-T细胞的整体概念是，T细胞可以被改造以表达肿瘤特异性抗原的CAR，从而一旦识别到肿瘤抗原就可以激活T细胞。CAR的典型结构是一个单链可变区（scFv）链接胞内的信号传导模块。然后scFv与肿瘤抗原结合，在特异性抗原下CAR激活T细胞而不是MHC方式。CAR-T治疗急性淋巴细胞白血病的临床试验显示出了令人难以置信的疗效，完全缓解率近90%。然而，尝试用CAR-T治疗实体瘤的效果一直不太理想，并且正致力于提高CAR-T在实体瘤内的活性和靶向特异性。
由于CAR-T在体外可有效裂解肿瘤细胞，CAR-T无法在体内实体瘤中发挥作用的可能性之一是T细胞不能穿透肿瘤屏障。在胸膜恶性肿瘤中，Adusumilli等人对CAR-T不同给药途径的疗效进行评估。他们发现，CAR-T细胞胸膜局部给药达到完全缓解比全身给药更加有效，所需要的CAR-T细胞要少30倍。有意思的是，尽管通过全身给予大量CAR-T细胞使其在肿瘤组织中累积的数量与局部给予的类似，但是全身给药途径的CAR-T细胞的抗肿瘤效果和功能较弱。这些数据表明TME不仅可以阻止T细胞进入肿瘤，并且能够迅速降低其浸润肿瘤的活性。
TME可以在肿瘤组织周围形成生物屏障以阻碍淋巴细胞的渗透。其中之一便是ECM。活化的T细胞为了能进入并破坏肿瘤组织，它们通常分泌酶以对ECM进行降解。Caruana等人的一项出色的研究中显示，这些酶之一乙酰肝素酶在CAR-T细胞中表达下调。乙酰肝素酶是一种内切糖苷酶，它可以切开ECM的重要组成部分，硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸乙酰肝素链。因此，CAR-T细胞乙酰肝素酶缺乏大大削弱了其穿透肿瘤的能力。令人关注的是，将CAR-T细胞改造成过表达肝素酶可显著增强降解ECM的能力，以增强其肿瘤浸润和抗肿瘤活性。
调控TME的趋化因子/细胞因子的分布
趋化因子
淋巴细胞的转运和迁移受趋化因子的调控，对趋化因子进行调控可以募集足量的效应细胞进入肿瘤组织对肿瘤进行杀伤。所有介导T细胞趋化作用的趋化因子，如趋化因子（C-C基元）配体21（CCL21）和CXC基元趋化因子10（CXCL10），都非常重要。
CCL21， 即CCR7配体，是介导DC和T细胞归巢到淋巴和非淋巴组织的一个重要的趋化因子。在早期研究中，瘤内注射CCL21可完全根除肺癌模型中的肿瘤。再者，表达CCL21的DC细胞伴随肿瘤浸润CD8+T细胞介导肿瘤消退，从而使肿瘤得到根除。在另一项研究中，Shields等人敲除了恶性黑色素瘤模型中CCL21，并且惊奇地发现肿瘤细胞表达高水平CCL21建立了免疫耐受TME并促进了肿瘤的进展。与此相反，CCL21缺陷型肿瘤生长慢得多，并诱导肿瘤特异性T细胞的应答。这些研究中相矛盾的结论可能是由于TME的不同，如肿瘤模型或表达CCL21的细胞类型不同。总的来说，这些研究表明使用趋化因子处置TME时，要谨慎选择效应细胞和靶细胞。
募集T细胞的另一个趋化因子是CXCL10，即CXCR3配体。da Silva等人的最近研究显示，二肽基肽酶4（DPP4）负责在肿瘤组织中灭活CXCL10。抑制DDP4酶活性以保持CXCL10活性，从而增加CXCR3+淋巴细胞转运到肿瘤组织。DPP4抑制后，高表达CXCR3的肿瘤浸润T细胞数量显著增加。本项研究进一步显示，DDP4抑制剂可以与其他免疫疗法联合使用，包括辅助型免疫治疗和免疫检查点封闭分子。增加肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）以改善当前免疫治疗的想法很具有吸引力，尽管本研究这方面进展还不显著。它仍然可能是不止一种趋化因子参与其中。
细胞因子
在肿瘤免疫治疗中趋化因子的总体疗效比其他免疫疗法逊色，这意味着针对单个趋化因子不足以募集足够的淋巴细胞来完全控制肿瘤。事实上，与免疫治疗时肿瘤中的趋化因子相比，我们实验室发现有些关于T细胞迁移的趋化因子明显不同（未公布数据）。相对于趋化因子，细胞因子是可以调节免疫应答的一大类蛋白质。细胞因子可直接激活免疫效应细胞或刺激肿瘤基质细胞，以致为淋巴细胞的募集产生的趋化因子和粘附分子。这些功能表明根据不同的肿瘤微环境，针对细胞因子也可以是肿瘤免疫治疗的一种有效途径。
在肿瘤方面研究最广泛的细胞因子是I型干扰素，几乎所有的细胞都会表达并在的抗肿瘤反应中发挥重要的作用。虽然全身给药重组I型IFN已用于临床治疗某些肿瘤，但由于干扰素受体分布广泛，这种治疗与高毒性相关。一些小组在测试利用抗体引导IFN特异于肿瘤组织的二代IFN。在Xuan等人的一项研究中，相对于游离的IFN-α，以IFN-α与抗CD20抗体连接形成融合蛋白，对已经成形的肿瘤显示出更强的溶瘤活性和更低的毒性。这种抗肿瘤作用主要由于独立于获得性免疫的直接杀伤，因为该种融合蛋白可以对裸鼠的异种移植肿瘤进行抑制。敲除肿瘤细胞的IFN受体会大大降低抗肿瘤效果，这表明抗CD20-IFN-α融合蛋白介导的抗肿瘤效果主要通过IFN受体直接诱导肿瘤细胞凋亡。然而，当T细胞存在时仍可参与整个抗肿瘤反应。在另一项研究中，Yang等人使用抗EGFR抗体引导IFN-β（抗EGFR-IFN-β融合蛋白）用作肿瘤的免疫治疗。类似于以前的研究，抗EGFR-IFN-β的融合蛋白也显示出强效的抗肿瘤活性。
Yang等人的数据明确显示，相对于在高剂量下抗CD20- IFN-α融合蛋白直接诱导肿瘤细胞凋亡，抗EGFR-IFN-β的融合蛋白的抗肿瘤效果依赖于获得性免疫。具体而言，抗EGFR-IFN-β融合蛋白靶向DC细胞以增加抗原交叉呈递，以致在TME中增加T细胞致敏;为了支持这一观点，对DC细胞的IFN受体条件性敲除会完全消除其抗肿瘤能力。
这些研究之间的差异不足为奇。事实上，类似的矛盾现象已经在使用游离的I型干扰素进行肿瘤免疫治疗中被发现，在某些模型中IFN可以促进肿瘤细胞的生长，而在其他情况下机体需要IFN增强免疫来控制肿瘤。自身免疫是否受IFN的影响似乎依赖于TME中IFN的表达水平。由于低剂量的IFN-β的不能结合肿瘤组织中所有的IFN受体，因此机体免疫对肿瘤的控制需要优化。与此相反，在肿瘤组织局部给予高剂量的IFN-β可诱导肿瘤血管的破坏，导致肿瘤消除。后一种过程与T、B或NK细胞相关。总之，从这些研究中可以得到，免疫调节剂的剂量可导致免疫疗法与TME之间完全不同的相互作用。
淋巴细胞充分浸润到肿瘤组织是免疫治疗成功的关键。事实上，在各类癌症的治疗中TIL的存在与良好的预后密切相关。趋化因子和细胞因子可以募集淋巴细胞尤其是T细胞进入肿瘤组织，将TME从免疫抑制状态转换到免疫增强状态。IFN被认为其中之一。然而，在实验室初步研究表明，TIL的增加只在某些肿瘤模型中观察到，这有可能与干扰素多种下游效应有关（未发表的结果）。
另一个可以在TME中强力增加TIL的是LIGHT（也称为肿瘤坏死因子超家族成员14[TNFSF14]），一个可以调节T细胞活化的共刺激分子。膜定位的全长LIGHT在蛋白酶的作用下可以转换为分泌型的细胞因子。我们实验室的研究显示，LIGHT在肿瘤细胞中强制表达可促进淋巴样结构形成以引导T细胞聚集与活化，从而导致肿瘤的消退。
LIGHT是结合了疱疹病毒侵入介质（HVEM）和淋巴毒素β受体（LTβR）两个不同受体的配体蛋白。LIGHT结合的HVEM向T细胞传递共刺激信号，LTβR通常表达于非淋巴细胞，是形成二级和三级淋巴结构的关键。LTβR在淋巴结的构造和次级淋巴器官的不同T细胞和B细胞组织中发挥关键作用。通过LTβR信号调控各种趋化因子和粘附分子的表达以控制脾脏内DC和淋巴细胞的迁移与定位。因此，相对于只靶向一点的趋化因子，肿瘤基质细胞中LIGHT的LTβR信号激活诱导表达多种趋化因子和粘附分子向TME募集效应T细胞。
多种趋化因子的诱导使LIGHT对淋巴细胞的募集和活化比单个趋化因子和细胞因子更有效。总之，针对TME使用细胞因子以诱导免疫环境被广泛研究，以支持它们可能是治疗癌症的一种有效方法这一观点。
PRR激动剂
模式识别受体（PRR）是一类表达于原始细胞可以从细胞应急和病原体感应危险信号的的一类保守蛋白质。通过PRR信号诱导可以使免疫反应细胞因子表达，以致先天和获得性免疫的激活。已经开发了几个模仿危险信号的PRR激动剂，并已在临床前和临床研究中应用。其中，CpG具有最有效的抗肿瘤活性，并已在小鼠研究中广泛使用，包括单独使用或与其他疗法联用。抗体引导的CpG定位到肿瘤组织可诱导肿瘤完全消退。这个过程伴随着DC的活化和全身抗肿瘤免疫反应。但是，应该指出的是的CpG的抗肿瘤作用在小鼠模型中比人类中的效果更突出，这有可能是因为TLR9表达形式的差异。
大多数合成PRR激动剂衍生自微生物相关分子形态。然而，当两项研究揭示TME中干扰素基因（STING）途径刺激因子识别危险信号的关键作用时，到目前为止在生理条件下TME中PRR信号在很大程度上还未能确定。STING是连接PPR到IRF3活化的一个配体蛋白。Woo等人研究表明STING通路在识别肿瘤来源的DNA中起重要作用，可导致IFN-β产生。STING途径缺陷减少了IFN-β的产生，从而导致小鼠中肿瘤控制缺陷。Deng等人的补充研究显示STING也是识别放射治疗后肿瘤释放的DNA的关键；此外，他们证明了cGAMP，即STING激动剂可以增强放射治疗的抗肿瘤作用。
结论
免疫反应是一种动态的和复杂的过程，其中不同的机制彼此制约，以保护该机体、组织和细胞，包括来自免疫杀伤的肿瘤细胞。TME是免疫抑制和免疫增强交汇的位置，但通常免疫抑制占主导地位。最近检查点阻断技术体外抗体制药的成功证明了这一观点，其表明操纵不同的信号通路可以创建比以往更有效的疗法。
另一方面，患者相对低的反应率表明当前的免疫疗法仍然存在阻碍，在许多情况下不能够释放其全部潜力。因此，本文编译作者Paul Hsu认为我们对这些免疫机制的理解还有很大的上升空间。随着研究人员对TME和免疫治疗认识的深入，会出现更多处置TME以及提高目前的免疫治疗的疗效的方法。
